Žádné duplikáty
Bez amplifikačního kroku nevzniknou žádné PCR duplikáty. Celý sekvenační výstup reprezentuje unikátní molekuly — bez duplikátů, víc užitečných čtení při stejné kapacitě.
Twist Bioscience · NGS portfolio
PCR-Free WGS Library Prep Kit
Příprava knihovny pro celogenomovou sekvenaci bez PCR amplifikačního kroku. Žádné PCR duplikáty, výrazně snížené GC zkreslení a delší inzerty pro lepší detekci strukturních variant.
- PCR-free Žádné duplikáty, žádné PCR chyby
- 40–300 ng Široký rozsah vstupu DNA
- ~400 bp Konzistentní medián inzertu
Co je PCR-FREE WGS
Příprava knihovny bez PCR amplifikace
Standardní WGS postup používá PCR amplifikační krok, který sice zvedne výnos z nízkovstupního vzorku, ale zároveň vnáší duplikáty, GC bias a zkresluje pokrytí v opakujících se a GC-bohatých oblastech. Twist PCR-free WGS Library Prep Kit tento krok kompletně vynechává — DNA prochází enzymatickou fragmentací a ligací adaptérů, hotovo. Žádné PCR.
Výsledek: knihovna, která věrně odráží distribuci původního genomu. Lepší pokrytí GC- a AT-bohatých oblastí, delší inzerty (medián ~400 bp) a citlivější detekce strukturních variant i repetitivních oblastí. Kit funguje s vstupem 40–300 ng DNA.
Hlavní výhody
Proč PCR-free postup
Minimální GC bias
Normalizované pokrytí zůstává blízko hodnoty 1,0 napříč rozsahem GC obsahu 10–90 %. Bez nadměrného nad- nebo podsekvenování GC bohatých oblastí.
Snížený výpadek v AT oblastech
PCR-free postup zachovává nativní obraz, eliminuje výpadky v AT-bohatých oblastech a zlepšuje uniformitu pokrytí napříč obtížnými místy genomu.
Delší inzerty pro strukturní varianty
Medián ~400 bp inzertů zlepšuje přesnost mapování a citlivost detekce strukturních variant. Méně zkreslení směrem ke krátkým fragmentům.
Konzistentní výnos při nízkém vstupu
Optimalizovaná chemie ligace udrží výnos knihovny i při nejnižším testovaném vstupu 37,5 ng DNA — knihovna nad 2 nM.
Jak to funguje
Workflow ve třech krocích
01
Enzymatická fragmentace
Nativní DNA je fragmentována při 25 °C po dobu 15 min. Bez ultrasoniku, bez kovalentních modifikací — jen čistá enzymatická chemie s konzistentními výsledky napříč vstupy.
02
Ligace adaptérů
Optimalizovaná Twist ligáza zajišťuje vysokou účinnost ligace adaptérů a zároveň omezuje vznik zkreslení. To vše bez následné PCR amplifikace.
03
QC a sekvenace na NovaSeq X
qPCR kvantifikace knihovny (např. Kapa Library Quantification), pooling až 1 536 vzorků a sekvenace na NovaSeq X. Loading threshold ≥ 2 nM — splněno i při nejnižším testovaném vstupu 37,5 ng.
Naměřená data
Konzistentní výsledky napříč vstupy
Koncentrace knihovny, velikost inzertu a uniformita pokrytí GC obsahu zůstávají stabilní v celém testovaném rozsahu od 37,5 ng do 300 ng DNA.
Koncentrace knihovny vs. vstup DNA
~15 nM při 300 ng vstupu, ~4–5 nM při 75 ng a ~2,3 nM při 37,5 ng. Vždy nad prahem 2 nM.
Kvalita knihovny
Konzistentní velikost knihovny ~3,3 × 10¹⁰ molekul při 300 ng, ~2,2 × 10¹⁰ při 37,5 ng. Vysoký konverzní výnos.
Normalizované pokrytí vs. GC obsah
Normalizované pokrytí blízko 1,0 napříč rozsahem GC 10–90 % pro všechny tři vstupy. Bez zkreslení na extrémech GC obsahu.
Podívejte se
PCR-free WGS Kit v akci
Krátké video představuje workflow Twist PCR-free WGS Library Preparation Kit od fragmentace po loading na NovaSeq X.
Pojďme začít
Zaujal vás Twist PCR-free WGS kit?
Konzultujte s námi vhodné použití pro vaši aplikaci. Pomůžeme s otestováním protokolu a jeho validací přímo ve vaší laboratoři, včetně technické podpory.